摘要：目的探讨牡荆苷（VT）对急性脑缺血（ACI）再灌注大鼠的神经保护作用及对辅助性T细胞1（Th1）/Th2漂移的影响。方法制备ACI再灌注大鼠模型，分为模型组，VT低、中、高剂量（0.94、1.88、3.76mg/kg）组和假手术组，缺血再灌注1h后，VT各剂量组大鼠ip不同浓度VT，假手术组和模型组大鼠ip等量生理盐水，连续3d。观察大鼠一般状态，评估给药前后Longa神经功能评分、给药后脑组织神经元细胞形态学变化；对比各组大鼠脑组织DNA单链、双链断裂损伤率；检测大鼠脑组织中Th1、Th2标记物γ干扰素（INF-γ）、白细胞介素-4（IL-4）水平，计算INF-γ/IL-4。结果ACI再灌注建模成功率为88.89%，建模大鼠均出现精神状态不佳现象，给药后VT各剂量组大鼠状态均有所好转。与模型组比较，VT各剂量组大鼠给药1、3d后神经功能评分均显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。HE结果显示，模型组大鼠神经元细胞体积缩小、细胞核固缩，VT各剂量组大鼠给药后神经元细胞损伤均有所减轻，其中高剂量组减轻最为明显。与假手术组比较，模型组大鼠DNA单链、双链断裂损伤率，INF-γ水平及INF-γ/IL-4较显著升高（P＜0.05），IL-4水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，VT各剂量组大鼠DNA单链、双链断裂损伤率，INF-γ水平及INF-γ/IL-4均显著降低（P＜0.05），IL-4水平显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。结论VT对ACI再灌注大鼠神经功能具有保护作用，其中VT3.76mg/kg保护作用最佳，可能与调节Th1/Th2细胞平衡向Th2漂移、减轻脑细胞DNA损伤有关。
急性脑缺血（ACI）是临床常见缺血性脑血管疾病，是人类三大致死病因之一，致残率、致死率极高，给人民的生命安全造成严重威胁[1]。目前临床中多采用溶栓治疗ACI，但对抢救时间窗有严格要求，且仍有部分患者及时治疗后效果不佳[2]。缺血再灌注损伤在ACI发病及治疗过程中起重要作用，涉及氧化应激、炎症反应等多个过程，可导致脑细胞持续损伤，存活者多遗留神经功能障碍[3]，生命质量严重下降，因此寻找有效药物保护ACI再灌注后神经功能对患者预后有重要意义。近年来，中药因其低*、高效、来源广泛，在临床中广泛应用于心脑血管病的防治。牡荆苷（VT）是金莲花、红草等毛莨科植物的有效成分，属于*酮碳苷类化合物。研究证实[4-5]，VT具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物学活性，但关于其对ACI再灌注后神经保护作用及其调控机制鲜有报道。为此，本研究通过建立ACI再灌注大鼠模型，以不同浓度的VT进行干预，探讨VT对ACI再灌注大鼠的神经保护作用及可能调控机制。
1材料
1.1实验动物
SPF级雄性SD大鼠，55只，8周龄，体质量～g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）-。
1.2药物、试剂和仪器
VT（批号FY，质量分数≥98.50%），南通飞宇生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，Sigma公司）；琼脂糖（低熔点、正常熔点）、二甲基亚砜（DMSO），华美生物工程有限公司；γ干扰素（INF-γ）、白细胞介素-4（IL-4）ELISA检测试剂盒，美国Mybiosource公司；BX60型荧光显微镜，日本Olympus公司；DYY-12D型电泳仪、水平电泳槽，北京六一生物科技有限公司。
2方法
2.1模型制备
选取55只Wistar大鼠，其中45只采用Longa线栓法建立ACI再灌注大鼠模型：采用10%水合氯醛ip麻醉后，仰卧位固定于手术台，颈部消*备皮，作颈正中切口，沿气管两侧顿性分离双侧颈总动脉（CCA），穿线后提起CCA，微动脉夹夹闭双侧CCA20min，然后取下微动脉夹灌注1h，最后抽去穿线缝合切口。剩余10只大鼠仅穿线，未进行夹闭操作。大鼠清醒后采用Longa法[6]评估神经功能，无神经功能缺陷症状记0分；左前爪不能完全伸展记1分；向左转圈记2分；左侧倾倒记3分；不能行走、意识昏迷记4分；Longa神经功能评分1～3分为模型制备成功。
2.2分组及给药
将模型制备成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组和VT低、中、高剂量组，未进行夹闭操作大鼠为假手术组。缺血再灌注1h后VT低、中、高剂量组大鼠分别ip给予0.94、1.88、3.76mg/kgVT（VT-DMF-生理盐水1∶1∶20），模型组和假手术组大鼠ip等量DMF生理盐水溶液（DMF-生理盐水1∶20），每天1次，连续3d。
2.3神经功能评估
于给药前及给药1、3d后分别应用Longa法评估神经功能。
2.4脑组织神经元细胞形态学观察
神经功能指标末次评估结束后，大鼠ip10mL/kg0.3%戊巴比妥钠溶液麻醉，迅速开胸暴露心脏，用生理盐水快速灌注mL，迅速断头，冰台下取脑组织，置于4%多聚甲醛中固定48h，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，以视交叉处为起始部位向后制作冠状切片，切片厚度为5μm，采用苏木精-伊红（HE）染色法对切片进行染色，石蜡树胶封片后，于光学显微镜下观察脑组织神经元细胞形态学变化。
2.5脑组织DNA链断裂损伤率测定
神经功能指标末次评估结束后，处死大鼠，冰台下迅速取脑组织，将缺血半球去除额极、枕极及矢状缝内侧各2mm大脑皮质及基底节，取mg
梗死区脑组织制备脑组织匀浆液，采用研磨法作单细胞悬液（细胞密度为1×个/mL），进行中性和碱性单细胞凝胶电泳（SCGE）。①制胶：在载玻片上制胶，下层为正常熔点琼脂，上层为含1×个单细胞的低熔点琼脂。②裂解：取下盖玻片，立即浸入新鲜配置的中性裂解液或碱性裂解液，4℃下裂解2h。③解旋及电泳：取玻片中流水洗涤2次，放置于水平含中性或碱性电泳液的电泳槽中，电泳20min。④溴化乙锭染色，PBS洗涤后盖盖玻片，荧光显微镜下观察细胞图像，计数个细胞，以迁移距离＞70μm的细胞判定为拖尾细胞，中性SCGE中拖尾细胞占总细胞数百分比即为DNA双链断裂损伤率，碱性SCGE中拖尾细胞占总细胞数百分比即为DNA单链断裂损伤率。
2.6脑组织Th1、Th2标记物INF-γ、IL-4水平检测
取部分梗死区脑组织，称质量后按照1∶9加入预冷生理盐水，匀浆后，r/min离心10min，取上清液，采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书步骤操作，制作标准曲线，然后计算上清液中Th1、Th2标记物INF-γ、IL-4水平，计算INF-γ/IL-4。
2.7统计学分析
采用SPSS20.0统计软件分析处理数据，计量资料均以描述，重复计量资料比较采用重复测量方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验；多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。
3结果
3.1大鼠一般情况观察
共55只大鼠，对照组10只正常存活，45只大鼠制备ACI再灌注模型，其中手术结束24h内死亡4只，1只Longa神经功能评分为4分模型制备失败，模型成功率为88.89%（40/45）。模型大鼠均出现精神萎靡、喜卧、反应迟钝及采食量下降现象，假手术组大鼠苏醒后精神状态逐渐转好，12h后反应及采食量逐渐正常，给药后各组大鼠精神状态均有所好转。
3.2VT对ACI再灌注大鼠神经功能评分的影响
假手术组大鼠神经功能评分均为0分。治疗前4组大鼠神经功能评分比较无显著差异。给药1、3d后，与模型组比较，VT低、中、高剂量组大鼠神经功能评分显著降低（P＜0.05）。与VT低剂量组比较，VT中剂量组大鼠神经功能评分在给药3d后显著降低（P＜0.05）。与VT低、中剂量组比较，VT高剂量组大鼠神经功能评分在给药1、3d后均显著降低（P＜0.05）。与给药前比较，除VT低剂量组外，各给药组大鼠的神经功能评分在给药1、3d后均显著降低（P＜0.05）。与给药1d比较，除VT低剂量组外，各给药组大鼠的神经功能评分在给药3d后均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。
3.3VT对ACI再灌注大鼠神经元细胞形态的影响
HE结果显示，假手术组大鼠神经元细胞形态正常，模型组大鼠神经元细胞体积缩小、细胞核固缩，VT低、中、高剂量组大鼠在给药3d后细胞皱缩与细胞核深染情况均有所减轻，其中VT高剂量组减轻最为明显，结果见图1。
3.4VT对ACI再灌注大鼠脑组织DNA链断裂损伤的影响
与假手术组比较，模型组大鼠脑组织DNA单链、双链断裂损伤率均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，VT各剂量组大鼠脑组织DNA单链、双链断裂损伤率均显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。结果见表2。
3.5VT对ACI再灌注大鼠脑组织INF-γ、IL-4水平及INF-γ/IL-4的影响
与假手术组比较，模型组大鼠脑组织INF-γ水平显著升高，IL-4水平显著降低，INF-γ/IL-4显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，VT各剂量组大鼠脑组织INF-γ水平显著降低，IL-4水平显著升高，INF-γ/IL-4显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。结果见表3。
4讨论
随着饮食结构的调整及老龄化日益严重，ACI已成为危害人们健康的主要疾病之一，其发病原因多样，高龄、糖尿病、高血脂症、过量运动及遗传因素等均是导致ACI发生的危险因素[7]。ACI再灌注损伤的发生涉及复杂的病理生理过程，涉及兴奋性氨基酸*性作用、钙离子内流、过量氧自由基生成清除障碍等机制，可加重或持续造成脑神经元细胞损伤，影响神经功能，严重者引发机体多系统损害，甚至死亡，因此，ACI再灌注治疗过程中的神经保护至关重要[8-9]。近年来研究发现，Th1/Th2漂移与脑缺血再灌注损伤关系密切[10]，可通过调节局部组织内促炎因子和抗炎因子水平而加重损伤程度，影响预后恢复，因此，寻找有效药物调节Th1/Th2间的平衡状态，对减少缺血再灌注损伤十分重要。
Longa线栓法闭塞再灌注大鼠中动脉与临床中ACI再灌注发病过程相似，且操作简单，模型成功率较高，已成为目前研究ACI再灌注的经典模型之一[11]。本研究将Longa神经功能缺陷评分在1～3分设定为模型制备成功的标准，符合临床中ACI发病时向脑缺血部位对侧倾倒的临床症状[12]，在ACI缺血再灌注后，给予不同剂量VT进行干预，发现各组大鼠神经功能功能评分均有所下降，且与给药剂量呈显著正相关，提示VT对ACI再灌注神经功能具有保护作用。VT属于*酮碳苷药物，临床关于VT的研究主要集中于抗病*、抗炎等方面。蒋伟等[13]应用不同剂量VT对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠进行干预，发现VT可显著改善海马区神经元细胞结构和功能，对衰老小鼠脑损伤具有保护作用。本研究HE染色结果显示，模型组大鼠神经元细胞损伤严重，VT各剂量组大鼠给药3d后细胞损伤情况均有所减轻，VT高剂量组大鼠减轻最为明显，提示VT对ACI再灌注大鼠神经功能具有保护作用，其中3.76mg/kg保护作用最佳。
此外，本研究中，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织DNA单链、双链断裂损伤率，INF-γ水平及INF-γ/IL-4较显著升高（P＜0.05），IL-4水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，VT各剂量组大鼠脑组织DNA单链、双链断裂损伤率，INF-γ水平及INF-γ/IL-4均显著降低（P＜0.05），IL-4水平显著升高（P＜0.05），其中VT高剂量组大鼠给药3d后上述指标变化最大，提示VT对ACI再灌注大鼠神经功能的保护作用可能与调节Th1/Th2细胞平衡向Th2漂移有关。ACI发病过程涉及的多种病理反应最终均会作用于损伤区域细胞的DNA，使细胞的DNA双链和单链损伤而断裂，而缺血再灌注损伤会加重脑细胞DNA损伤[14]。本研究应用VT对ACI再灌注大鼠干预后发现，脑组织DNA单链、双链断裂损伤率均降低，说明缺血再灌注损伤减轻，脑组织细胞损伤范围减小。研究发现，T淋巴细胞在脑缺血再通的早期阶段可部分被激活，参与脑组织损伤过程，但具体调控机制尚未阐明，通过分析发现，可能是通过调控Th1细胞分泌促炎因子（INF-γ、肿瘤坏死因子-α等）、Th2细胞分泌抗炎因子（IL-4、IL-10等）发挥调控作用[15-16]。VT等*酮类药物对一氧化氮（NO）等自由基具有清除作用，而NO属于体内信号转导气体信号分子[17]，参与调节IL-2、TNF-γ的合成和分泌，IL-2、TNF-γ可诱导Th细胞向Th2、Th1亚群分化，从而间接调控Th1/Th2平衡向Th2漂移。本研究应用不同浓度VT对ACI再灌注大鼠进行干预，有效降低了缺血再灌注后脑组织细胞的DNA链断裂损伤率，同时改善Th1/Th2失衡状态，证实VT可能通过调节Th1/Th2失衡、减少炎症对脑细胞的损伤而起到保护神经功能的作用。
综上所述，VT对ACI再灌注大鼠神经功能具有保护作用，其中3.76mg/kg保护作用最佳，可能与调节Th1/Th2细胞平衡向Th2漂移有关，为临床中VT相关药物的研发及应用于ACI再灌注神经保护的相关治疗中提供理论支持，但关于VT是否同时通过其他调控机制发挥神经保护作用仍需进一步研究。
参考文献（略）
来源：刘磊，吴一飞.牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用及对其Th1/Th2漂移的影响[J].中草药,,50(11):-.
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