摘要：目的探讨牡荆苷通过调控核转录因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）通路对急性脑缺血再灌注大鼠氧化应激反应的作用。方法54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照依达拉奉（0.56mg/kg）组和牡荆苷低、中、高剂量（10、20、40mg/kg）组，除假手术组外均制备急性脑缺血大鼠模型，再灌注后假手术组、模型组大鼠ip生理盐水，依达拉奉组和牡荆苷各剂量组按照相应剂量ip给药，8h给药1次，共3次。对比干预前后大鼠神经行为学评分；HE染色检测大鼠大脑皮质病理变化；试剂盒检测大鼠大脑皮质组织氧化应激指标丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblotting检测大鼠大脑皮层Nrf2/ARE通路相关基因mRNA与蛋白表达水平。结果干预前后假手术组大鼠神经行为学评分无明显变化，模型组较干预前增高（P＜0.01），依达拉奉组、牡荆苷各剂量组均较干预前降低（P＜0.01），且干预后各组间神经行为学评分比较差异显著（P＜0.01）。假手术组大鼠大脑皮质组织神经细胞分布均匀、密集，神经细胞的胞体、胞核形态正常；模型组、依达拉奉组和牡荆苷各剂量组大鼠脑组织神经细胞排列均有紊乱、疏松，其中模型组可见液化性坏死、细胞结构消失等表现；牡荆苷低剂量组可见细胞排列严重紊乱、疏松，部分液化性坏死、细胞结构消失；牡荆苷中剂量组和依达拉奉组液化性坏死部分面积小，大多细胞结构正常；牡荆苷高剂量组仅可见极少液化性坏死，细胞结构基本正常，细胞排列轻微紊乱。与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮质MDA和NO水平显著升高（P＜0.01），SOD和GSH水平显著降低（P＜0.01），Nrf2、γ-GCSmRNA表达水平显著升高（P＜0.01），细胞质Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，依达拉奉组和牡荆苷低、中、高剂量组大鼠大脑皮质MDA和NO水平均显著降低（P＜0.01），SOD和GSH水平显著升高（P＜0.01），Nrf2、γ-GCSmRNA表达水平显著降低（P＜0.01），细胞质Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。且牡荆苷各剂量组大鼠大脑皮质MDA、NO、SOD、GSH水平及Nrf2、γ-GCS、HO-1mRNA和蛋白表达水平均呈剂量依赖性，组间差异显著（P＜0.01）。结论牡荆苷可减轻急性脑缺血再灌注大鼠氧化应激反应，推测与调控Nrf2/ARE信号通路，上调Nrf2基因与蛋白表达，促进其由细胞质向细胞核移动，上调HO-1表达，抑制γ-GCS表达，增强机体的抗氧化应激反应能力有关。
急性脑缺血是指由于脑部血管血液供应不足突然出现的急性缺血性脑血管病，可出现头晕、视物模糊/旋转等症状，多由于颅内动脉系统或椎-基底动脉血流突然中断所致。急性脑血管病多发生在60岁以上人群，可导致局部脑组织血流供应障碍，还可由于缺血、缺氧等导致脑组织软化，增加细胞凋亡，损伤相应的神经功能[1-2]。据统计[3]，我国急性脑缺血发病率较高，每年有超过万新发病例，且死亡率较高，其中仅急性期死亡者占比高达10.5%～38%。血管再通是目前急性脑缺血疾病患者常用的治疗方案，但是再灌注时可诱发脑组织炎症反应和氧化应激反应损伤，需加强控制[4]。牡荆苷具有抗肿瘤、脑组织保护等作用，有研究发现牡荆苷可减轻急性脑缺血再灌注所致的脑组织损伤[5]，证实其在此类疾病治疗方面有良好的应用价值。但是牡荆苷是否可减轻氧化应激反应仍需深入研究。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）通路是经典的氧化应激反应调控通路[6]，牡荆苷是否可通过调控该通路发挥抗急性脑缺血再灌注大鼠的氧化应激损伤尚鲜有相关报道。鉴于此，本研究制备急性脑缺血再灌注大鼠模型，探讨牡荆苷对其氧化应激损伤的保护作用，以期为牡荆苷的应用及药理研究奠定基础。
1材料
1.1实验动物
SPF级SD大鼠54只，雌雄各半，体质量～g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK（京）-，合格证号213。
1.2药品与试剂
依达拉奉（批号A，质量分数≥99%，海南龙圣堂制药有限公司）；牡荆苷（批号，质量分数≥98%，上海纪宁实业有限公司）；丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（美国Bio-Rad公司）；Trizol试剂盒（美国Invitrogene公司）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（深圳晶美生物科技有限公司）；化学发光（ECL）试剂盒（大连宝生物科技有限公司）；兔抗鼠Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）单克隆抗体，山羊抗兔过氧化物酶标记的Nrf2、HO-1和γ-GCS多克隆抗体（美国Acdam公司）；电泳凝胶（北京泛博生物化学有限公司）。
1.3仪器
36XL型光学显微镜（上海光学仪器厂）；H型台式离心机（湖南湘仪仪器厂）；QuantStudioTM3D型聚合酶链反应（PCR）仪（美国ABI公司）；DYCZ-20G型基因检测电泳仪、DYCP-31E型蛋白检测电泳仪（北京六一仪器厂）；型CO2培养箱（美国Thermo公司）；ZF-型凝胶成像分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）。
2方法
2.1分组、模型制备与给药
54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药依达拉奉（0.56mg/kg）组和牡荆苷低、中、高剂量（10、20、40mg/kg，即1.62、3.24、6.48μmol/kg）[5]组，每组9只，除假手术组外均制备急性脑缺血大鼠模型。大鼠称定质量后麻醉（ip水合氯醛mg/kg），仰卧位固定于手术台上，备皮消*。参照文献方法[7]制备脑缺血/再灌注模型，持续阻断双侧颈总动脉5min，然后血液再灌注。假手术组与上述操作完全相同，但仅对双侧颈总动脉暴露、插线，不实施结扎处理。术后所有大鼠均预防性应用抗生素，再灌注后假手术组、模型组大鼠ip生理盐水，依达拉奉、牡荆苷各剂量组按照相应剂量ip给药，8h给药1次，共3次。
2.2神经行为学观察
采用Clark量表[8]对各组存活大鼠进行神经行为学评价，总分为0～28分，评分越低认为神经行为学越接近正常，注意各组均需要在干预前后评价。
2.3HE染色检测大鼠大脑皮质病理变化
于再灌注24h后麻醉大鼠，心脏灌注后处死，取脑缺血侧新鲜的大脑皮质组织，做病理切片。参照《病理学基础》[9]常规固定、包埋、切片、脱水、透明、浸蜡、水化，HE染色，镜下观察。
2.4氧化应激反应指标检测
于再灌注24h后麻醉大鼠，心脏灌注后取缺血侧新鲜的大脑皮质组织，将其表面的附属物去除，并以生理盐水冲洗，吸干水分后制作脑匀浆，浓度为10%。取MDA、NO、SOD、GSH检测试剂盒测定脑组织中的氧化应激反应指标。
2.5Nrf2/ARE通路相关基因mRNA表达检测
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测Nrf2、HO-1和γ-GCSmRNA水平。取大鼠大脑皮质组织，以液氮研磨，提取总RNA，检测RNA的纯度，要求所得产物、nm波长处吸光度（A）的比值为1.8～2.0。构建20μL反应体系，其中Nrf2上游引物：5’-ACGTAGATCGATATAGCTATGGGAT-CAGT-3’，下游引物：5’-CTGATAGCTAGATATTCA-GTATAGCTA-3’；HO-1上游引物：5’-ACGCTAGAT-ATTTAGATAGATCGAT-3’，下游引物：5’-ACGCTA-GATATGTTAGACTAGATC-GAT-3’；γ-GCS上游引物：5’-AGCTCGATATAGAT-CTAGATGCTAGT-3’，下游引物：5’-ACGCTAGATATAGCTATTTAGCAG-ATAGC-3’；β-actin上游引物：5’-CTGATAGATCA-GTAGCTATAGATCGATAAC-3’，下游引物：5’-TC-GCTAGATATTCGATATGGCTAGTAG-3’，长度均为20bp。反应条件：95℃、15min；92℃、10s，72℃、75s，60℃、15s，35个循环；54℃、10min。校正每个待检测样本的Ct值，计算ΔCt，2?ΔΔCt即为目的基因mRNA的相对表达。
2.6Nrf2/ARE通路相关蛋白表达检测
Westernblotting法检测细胞质Nrf2、细胞核Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白表达。取大鼠大脑皮质组织制备样品，细胞质和细胞核Nrf2蛋白表达检测时需制备细胞质和细胞核蛋白样品，电泳90min后转膜，封闭1h。加入一抗（1∶），4℃过夜。洗膜3次，加入二抗（1∶），室温孵育2h。洗膜并加入ECL试剂，其中细胞核Nrf2内参为H3，细胞质Nrf2、HO-1、γ-GCS内参均为β-actin，电泳并分析目的蛋白的相对表达。
2.7统计学分析
采用SPSS23.0软件进行统计学检验，多样本计量资料以单因素方差分析，每2组间差异以SNK-q检验，本组内干预前后对比以配对t检验。检验标准均为α＝0.05。
3结果
3.1牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠神经行为学影响
假手术组、模型组、依达拉奉组和牡荆苷低、中、高剂量组实验期间分别有0、2、1、1、0、0只大鼠死亡，多死于感染、咬伤等，死亡大鼠均剔除本研究。除假手术组外，干预前后各组神经行为学评分对比差异均显著（P＜0.01）。且干预后，各组间神经行为学评分比较差异显著（P＜0.01），见图1。
3.2牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质组织病理学影响
假手术组大鼠神经细胞分布均匀、密集，神经细胞的胞体、胞核形态正常。模型组、依达拉奉组和牡荆苷各剂量组大鼠脑组织神经细胞排列均有紊乱、疏松，其中模型组可见液化性坏死、细胞结构消失等表现；牡荆苷低剂量组可见细胞排列严重紊乱、疏松，部分液化性坏死、细胞结构消失；牡荆苷中剂量组和依达拉奉组大鼠神经细胞液化性坏死部分面积小，大多细胞结构正常，且2组病理学变化相近；牡荆苷高剂量组仅可见极少神经细胞液化性坏死，细胞结构基本正常，细胞排列轻微紊乱，见图2。
3.3牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质氧化应激反应指标的影响
与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮质MDA和NO水平显著升高（P＜0.01），SOD和GSH水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，依达拉奉组和牡荆苷低、中、高剂量组大鼠大脑皮质MDA和NO水平均显著降低（P＜0.01），SOD和GSH水平显著升高（P＜0.01）。且牡荆苷各剂量组大鼠大脑皮质MDA、NO、SOD和GSH水平呈剂量依赖性，组间差异显著（P＜0.01），见图3。
3.4牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质Nrf2/ARE通路相关基因mRNA表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮质Nrf2、γ-GCSmRNA表达水平显著升高（P＜0.01），HO-1mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，依达拉奉组和牡荆苷各剂量组大鼠大脑皮质Nrf2、γ-GCSmRNA表达水平显著降低（P＜0.01），HO-1mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。牡荆苷各剂量组大鼠Nrf2、γ-GCS和HO-1mRNA表达水平呈剂量依赖性，组间差异显著（P＜0.01），见图4。
3.5牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质Nrf2/ARE通路相关蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组大鼠大脑皮质细胞质Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，依达拉奉组和牡荆苷各剂量组大鼠大脑皮质细胞质Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01），细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）。牡荆苷各剂量组大鼠大脑皮质细胞质Nrf2、γ-GCS蛋白和细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达水平呈剂量依赖性，组间差异显著（P＜0.01），见图5。
4讨论
急性脑缺血再灌注可导致局部脑组织损伤，在此过程中氧化应激、炎症反应等均积极参与且起着至关重要的作用。研究发现[10]，急性脑缺血再灌注后机体氧化应激反应指标可出现明显异常，抗氧化应激能力则显著下降，其中MDA、NO水平显著升高，而SOD、GSH水平显著降低。MDA属于氧化终产物，会引起蛋白质、核酸等大分子交联聚合，并且具有细胞*性，其活性增强意味着机体脂质过氧化反应增强，可引发氧化应激损伤[11]。NO带有自由基，常发挥信使作用，属于强效抗氧化剂，在机体内其水平多处于动态平衡，一旦发生氧化应激损伤，可在短时间内生成大量NO以减轻氧化应激反应所致的损伤。SOD属于一种源于生命体的重要活性成分，可消除有害物质，维持良好的新陈代谢状态，其水平降低意味着机体抗氧化损伤的能力减弱[12]。GSH属于一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，具有整合解*、抗氧化等作用，也是衡量机体抗氧化能力的常用指标[13]。因此对急性脑缺血再灌注所致的损伤治疗时需积极控制氧化应激反应，调整上述指标，方可显著减轻脑损伤。
本研究中，牡荆苷各剂量和依达拉奉干预后大鼠神经行为学评分均下降，且脑组织病理损伤均减轻，脑组织MDA、NO、SOD和GSH水平均显著改善，其中牡荆苷中剂量组与依达拉奉组相近，牡荆苷各剂量的作用呈剂量依赖性，可知牡荆苷可改善急性脑缺血再灌注大鼠模型的神经行为学，减轻脑组织病理损伤，减轻氧化应激反应，且高剂量牡荆苷的作用效果最佳。牡荆苷具有较强的抗氧化应激反应能力，既往报道中均证实其对脑缺血再灌注、心肌缺血再灌注损伤有有良好的控制效果[14-16]，且抗氧化应激能力显著，在此类疾病临床治疗中显示出良好的挖掘价值和应用前景。牡荆苷属于一种*酮类化合物，是金银花中的主要成分，现代药理研究也证实其具有理想的体外抗氧化应激活性，且在既往实验中还证实该药物可以增强急性脑缺血再灌注小鼠机体的抗氧化应激损伤能力[17]。结合相关报道及本研究结果，可以推测牡荆苷对急性脑缺血再灌注大鼠具有抗氧化应激反应效用，因此可减轻神经和脑组织病理损伤，改善神经行为学状态。
此外，本研究还发现牡荆苷各剂量和依达拉奉干预后大鼠脑皮质Nrf2、γ-GCSmRNA表达均较模型组显著下降，且牡荆苷高剂量组最低，依达拉奉组与牡荆苷中剂量组均相近，牡荆苷低剂量组均最高，而HO-1mRNA表达的变化趋势相反，且在蛋白检测对比结果中显示模型组大鼠脑皮质细胞质Nrf2蛋白表达水平较高，而牡荆苷各剂量组大鼠细胞核Nrf2蛋白表达水平均较模型组升高，HO-1、γ-GCS蛋白表达与mRNA表达趋势一致，推测牡荆苷可能是通过调控Nrf2/ARE通路，促进细胞质中Nrf2蛋白向细胞核中移动，上调HO-1表达，抑制γ-GCS的表达实现抗急性脑缺血再灌注氧化应激反应所致的损伤的。Nrf2/ARE是常用的氧化应激反应变化研究信号传导通路，可调节细胞抗氧化应激能力，保护脑组织。静息状态下Nrf2可与其抑制因子相耦联，使其对细胞抗氧化物质的能力处于基础水平，当收到活性氧簇攻击后Nrf2被解耦联，向细胞质中大量释放，并且可结合ARE，启动抗炎蛋白、生长因子及抗氧化酶等调控氧化应激反应[18]。与此同时，Nrf2/ARE下游的HO-1、γ-GCS均可受到刺激，前者被显著抑制，而后者被激活，共同参与氧化应激和损伤。研究指出[19]，调控Nrf2/ARE信号通路可促进氧自由基恢复平衡，进而控制各种外源性刺激对机体产生的氧化应激损伤。既往已有研究证实在急性脑缺血再灌注大鼠抗氧化应激反应损伤治疗中调控该信号通路的重要性[20]。结合本研究结果和上述分析可知，牡荆苷很可能是通过调控该信号通路发挥抗急性脑缺血再灌注大鼠氧化应激反应，从而减轻病理损伤的。
综上，牡荆苷可控制急性脑缺血再灌注大鼠的氧化应激反应，且其作用呈剂量依赖性，还可改善神经行为学，减轻脑组织病理损伤，推测其通过调控Nrf2/ARE通路，增强Nrf2的表达并促使其向细胞核移动，上调HO-1的表达，抑制γ-GCS的活性实现上述作用的。本研究显示出牡荆苷在此类患者临床治疗中具有良好的应用价值，而如何利用该药物减轻此类患者局部脑组织的氧化应激损伤仍需探讨，应作为下一个重点研究的课题。
参考文献（略）
来源：刘磊，张静文，张新玥.牡荆苷调控Nrf2/ARE通路减轻急性脑缺血再灌注大鼠氧化应激反应研究[J].中草药,,51（5）:-.
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